Tinció de Gram.html



Cèl·lules d'Escherichia coli, gram (-), vistes mitjançant microscopia òptica amb tinció de Gram

La tinció de Gram és un tipus de tinció diferencial emprada en microbiologia per a la visualització de bacteris en mostres. Deu el seu nom a Christian Gram, bacteriòleg danés que desenvolupà la tècnica el 1844. S'utilitza indistintament tant per a referir-se a la morfologia cel·lular bacteriana com també per al 1r pas en la diferenciació bacteriana, considerant-se bacteri Gram-positiu als bacteris que es visualitzen de color violeta i bacteri Gram-negatiu a les que es visualitzen de color rosa.

edita Protocol

Cèl·lules de Bacillus cereus, bacteri gram(+), vistes mitjançant microscopia òptica amb tinció de gram(Gram +)

Després de diluir el bacteri en una gota d'aigua i fixar-la amb calor lleu, s'han de seguir els següents passos seqüèncialment:

1. Fixar les cèl·lules amb calor
2. Afegir Blau Violeta (Violeta de cristall) i esperar 30 segons. (Morats/Gram Positiu).
3. Esbandir amb aigua.
4. Afegir Lugol i esperar 30 segons.
5. Esbandir amb aigua.
6. Afegir alcohol i acetona.
7. Esbandir amb aigua.
8. Afegir safranina i esperar 1 minut. (Rosades/Gram Negatiu).
9. Esbandir amb aigua.

edita Explicació

El primer pas en qualsevol tinció ha de ser sempre la fixació amb calor. Després, en agregar el violeta de cristall, aquest ingressa a totes les cèl·lules bacterianes, tant Gram positives com Gram negatives).

El Lugol està format per I₂ (iode) en equilibri amb KI (iodur de potassi), el qual està present per a solubilitzar el iode. El I₂ entra en les cèl·lules i forma un complex insoluble en solució aquosa amb el violeta de cristall.

La mescla d'alcohol-acetona que s'agrega, serveix per a realitzar la descoloració, ja que en la mateixa és soluble el complex I₂/violeta de cristall. Els organismes Gram positius no es decoloren, mentre que els Gram-negatius si ho fan. Per a posar de manifest les cèl·lules gram negatives s'utilitza una coloració de contrast. Habitualment és un colorant de color roig, com la safranina o la fucsina bàsica. Després de la coloració de contrast les cèl·lules gram negatives es veuen roges, mentre que les gram positives romanen blaves.

La safranina pot o no utilitzar-se, no és crucial per a la tècnica. Serveix per a fer un tinció de contrast que posa de manifest els bacteris Gram negatius. Al terme del protocol, els Gram-positius es veuran blau-violades i els Gram negatius, es veuran roses, si no s'ha fet tinció de contrast; o roges, si es va usar, per exemple, safranina.

edita Observacions

• Sempre que es realitza el protocol, és fonamental realitzar el tractament amb violeta de cristall abans de fer el tractament amb iode. El iode, en absència del violeta de cristall, té poca afinitat per les cèl·lules, per la qual cosa es perd en els successius esbandits.
• El procés de descoloració no ha de ser extens, i ha de respectar-se el protocol quant al temps designat per als mateix. Així mateix, ha d'utilitzar-se poca aigua per a evitar la pèrdua de tinció dels Gram negatius.
• En treballar amb cultius de més de 24 hores, no es pot garantir la integritat de la paret cel·lular dels mateixos, i llavors el complex violeta de cristall/iode pot no ser retingut.

edita Utilitats

En l'anàlisi de mostres clíniques sol ser un estudi fonamental per complir diverses funcions:

• Identificació preliminar del bacteri causal de la infecció.
• Utilitat com a control qualitat de l'aïllament bacterià. Els morfotipus bacterians identificats en el tinció de Gram es deuen correspondre amb aïllaments bacterians realitzats en els cultius. Si s'observen nombre més gran de formes bacterianes que les aïllades cal reconsiderar els mitjans de cultius emprats així com l'atmosfera d'incubació.

A partir del tinció de Gram poden distingir-se diversos morfotipus distints:

• Els cocs són de forma esfèrica. Poden aparèixer aïllats després de la divisió cel·lular (Micrococs), aparèixer per parells (Diplococs), formar cadenes (Estreptococs), o agrupar-se de manera irregular (Estafilococs).

• Els bacils posseeixen forma allargada. En general solen agrupar-se en forma de cadena (Estreptobacils) o en palissada.

• També poden distingir-se els espirals, que es classifiquen en:
  • Espirils si són de forma rígida o
  • Espiroquetes si són blanes i ondulades.
• Si al contrari, posseeixen forma de "coma", o corbats, llavors se'ls designa vibrions.

edita Fonaments

Els fonaments de la tècnica es basen en les diferències entre les parets cel·lulars dels bacteris gram positius i gram negatius.

La paret cel·lular dels bacteris gram positius posseeix una gruixuda capa de peptidoglicà, a més de dues classes de àcids teicoics: Ancorat en la cara interna de la paret cel·lular i unit a la membrana plàsmatica, es troba l'àcid lipoteicoic, i més en la superfície, l'àcid teicoic que està ancorat només en el peptidoglicà, també conegut com mureïna.

Al contrari, la capa de peptidoglicà dels gram negatiu és prima, i es troba unida a una segona membrana plàsmàtica exterior, de composició diferent de la interna, per mitjà de lipoproteïnes. Té una capa fina de peptidoglicà unida a una membrana exterior per lipoproteïnes. La membrana exterior és feta de proteïna, fosfolípids i lipopolisacàrids.

Per tant, ambdós tipus de bacteris es tinyen diferencialment a causa d'aquestes diferències constitutives de la seua paret. La clau és el peptidoglicà, ja que és el material que confereix la seua rigidesa a la paret cel·lular bacteriana, i els gram positius el posseeixen en molta major proporció que els Gram negatius.

La diferència que s'observa en la resistència a la descoloració, se deu al fet que la membrana externa dels Gram negatius és soluble en dissolvent orgànic, com per exemple la mescla d'alcohol/acetona. La capa de peptidoglicà que posseeix és massa prima com per a poder retindre el complex de violeta de cristall/iode que es va formar prèviament, i per tant aquest complex s'escapa, perdent-se la coloració blava. Però al contrari, els Gram positius, en posseir una paret cel·lular més resistent i amb major proporció de peptidoglicans, no són susceptibles a l'acció del solvent orgànic, sinó que aquest actua deshidratant els porus tancant-los, la qual cosa impedeix que puga escapar-se el complex violeta de cristall/iode, i mantenint la coloració blava.